La deossinojirimicina (1-DNJ) è un alcaloide poliidrossilico simile alla piperidina estratto dalle foglie di gelso. Il suo nome chimico (2R,3R,4R,5S) -2-idrossimetil-piperidina-3,4,5-triolo, con formula molecolare C6H13NO4 e peso molecolare 163.17. Il DNJ è stato isolato e purificato per la prima volta dalla corteccia di radice di gelso dallo studioso giapponese Yoshiaki et al nel 1976. Oltre al gelso, l'1-DNJ e i suoi analoghi sono stati trovati anche nelle piante di Commelinaceae, giacinto e Psammophyllum, ma il loro contenuto era inferiore a quelli di Gelso. Il DNJ ha una struttura simile all'α-1, 4-glucosio ed è un potente inibitore dell'α-glucosidasi, che ha dimostrato di avere buoni effetti ipoglicemizzanti, ipoglicemizzanti e antiossidanti.

La fonte di DNJ

DNJ è stato estratto da piante e microrganismi. Secondo le letterature fin qui riportate, il Estratto di foglie di gelso ha il contenuto più abbondante di DNJ e il DNJ isolato dal microrganismo proviene principalmente da Streptomyces e Bacillus. È stato riscontrato che quasi tutte le parti del gelso contenevano DNJ, ma il contenuto di DNJ variava a seconda della specie, dell'area di coltivazione, del tempo di raccolta e del luogo di raccolta. Inoltre, è stato isolato anche da piante come Commelianceae, giacinto, Radix Platycodontidae e Pyrrhaceae. Sugiyama Makoto et al. primo DNJ isolato che produce Streptomyces SEN-158 e GC-148148 (Strep Tomyces Lavendulae) dal suolo. DNJ può anche essere prodotto con metodo sintetico. La tabella seguente mostra il contenuto di DNJ in diversi impianti.

Impianto Famiglia La parte contiene DNJ  Contenuto di DNJ
Gelso moraceae Radice

Branch di società

foglia

 0.624

0.0825-0.2382

0.08-0.344
Commelinacommunis selvatico Commeliate / 0.01125
Hyacinthus Liliacee/ Giacintocee Bulbo 0.0012
Psammofillo Giacintocee / 0.00086
Jacobinia suberetta Acanthaceae  foglia /

Estrazione, separazione e purificazione di DNJ

I metodi di estrazione di DNJ da Mulberry includono principalmente l'estrazione con acqua distillata, l'estrazione con acido cloridrico, la decozione dell'acqua deionizzata, l'estrazione con etanolo e l'estrazione assistita da microonde. Nella tecnologia di purificazione, la maggior parte del metodo della resina a scambio cationico, la tecnologia di purificazione della cromatografia inversa è anche una piccola ricerca. 1-DNJ esiste nelle cellule ed è solubile in acqua. Le strutture cellulari come la parete cellulare devono essere distrutte prima dell'estrazione. Pertanto, metodi assistiti come microonde e ultrasuoni sono favorevoli all'estrazione di 1-DNJ. I metodi specifici includono:

  1. Le foglie di gelso sono state schiacciate e messe in acqua distillata per il riscaldamento a riflusso. Dopo 2-2.5 ore, la soluzione acquosa è stata filtrata ed estratta nuovamente. La soluzione estratta è stata combinata due volte, filtrata, riscaldata e concentrata e quindi purificata con resina scambiatrice ionizzante.
  2. Decotto con 6 volte la quantità di acqua deionizzata 3 volte, ogni volta rispettivamente per 3 ore, 2 ore e 1.5 ore. Dopo tre volte di concentrazione del filtrato, è stato aggiunto un volume uguale di etanolo al 95%. Dopo 12 ore di riposo, la precipitazione è stata filtrata e l'etanolo è stato recuperato mediante decompressione per ottenere l'estratto grezzo DNJ con un tasso di recupero del 95.98%.
  3. DNJ è stato prima estratto con il metodo decotto con acqua deionizzata e quindi purificato con resina a scambio ionico 732 (tipo H). Il recupero medio di DNJ è stato del 96.1%.
  4. Le foglie di gelso sono state estratte con etanolo al 70%, resina di adsorbimento concentrata e macroporosa, resina a scambio cationico, acqua distillata, eluizione di ammoniaca 0.5 mol/L, purificata da gel di silice dopo concentrazione, combinata con componenti puri contenenti DNJ, concentrata ed essiccata sotto vuoto. Il contenuto di DNJ era del 23.2% e il tasso di estrazione era dello 0.355%.

Sono stati confrontati gli effetti di diversi fattori sulla velocità di estrazione di DNJ. Le condizioni di estrazione ottimali erano le seguenti: 65% di etanolo come agente di estrazione, rapporto solido-liquido 1:8, frantumazione cellulare potenziata a ultrasuoni 20 min (1800 W), velocità di estrazione del 95.8%; Purificato mediante resina a scambio cationico, la resa di DNJ era 124.54 mg/100 g e la purezza era superiore al 92.3%.

Alcuni studiosi hanno utilizzato l'estrazione assistita da microonde per estrarre 1-DNJ dalle foglie di gelso. L'estrazione assistita da microonde è la combinazione di estrazione a microonde e estrazione tradizionale con solvente. Attraverso il dipolo, nel materiale o nel solvente viene indotto un movimento molecolare, con conseguente riscaldamento del campione e il riscaldamento fa evaporare le cellule vegetali e perdere acqua. Una nuova tecnica di estrazione in cui il vapore produce espansione, provocando infine l'esplosione della cellula e il rilascio dei suoi principi attivi. L'estrazione di 1-DNJ è stata influenzata dal tempo di trattamento delle microonde, dalla potenza, dal rapporto solido-liquido e dai tempi di estrazione. Il processo di estrazione ottimale era il seguente: il tasso di estrazione di 1-DNJ era dello 0.024%, il tempo di trattamento con le microonde era di 1.5 minuti, la potenza era di 406 W, il rapporto solido-liquido era di 1∶40 e i tempi di estrazione erano 2. Confrontato con tecnologia di estrazione tradizionale, questo metodo presenta i vantaggi di bassa temperatura di estrazione, tempi di estrazione ridotti, nessuna inerzia termica (facile da controllare), alta efficienza, meno solventi e basso costo.

Metodo di rilevamento DNJ

1-DNJ appartiene all'alcaloide di tipo piperidina, che non contiene cromoforo come anello benzenico, doppio legame e gruppo carbonile e ha un basso assorbimento di luce nell'intervallo di lunghezze d'onda UV, quindi non può essere rilevato da un rivelatore UV. Inoltre, la struttura dell'alcaloide piperidinico contiene più gruppi idrossilici e la polarità molecolare è ampia, quindi è difficile essere qualitativi con il metodo di rilevamento fotometrico. Lo strumento utilizzato nella spettrofotometria ultravioletta è relativamente semplice, ma presenta lo svantaggio di una bassa sensibilità dovuta all'interferenza dei gruppi cromofori e di altre sostanze colorate.

I metodi di rilevamento comunemente usati per il contenuto di DNJ includono la cromatografia liquida ad alte prestazioni di derivatizzazione precolonna, la cromatografia liquida ad alte prestazioni, lo spettrofotometro, la cromatografia liquida ad alte prestazioni-rifrattometria differenziale, il metodo colorimetrico del sale di Leipton, la cromatografia meteorologica, ecc. L'intervallo lineare di ciascuno il metodo di rilevamento è diverso a causa della differenza delle condizioni cromatografiche (vedere la tabella seguente). Tra questi, il metodo HPLC-ELDS è più conveniente, veloce e sensibile. HPLC-ms /MS è un nuovo metodo di determinazione quantitativa per DNJ nelle foglie di gelso sviluppato da Nitra et al. Il suo limite di rilevamento (S/N = 3) è 75pg e il limite di quantificazione (S/N = 10) è 100pg, rendendo il rilevamento più sensibile.

Diversi metodi di rilevamento e parametri specifici di DNJ

Metodo di determinazione Derivato o agente cromogeno Rivelatore intervallo di linearità/μg/ml
Cromatografia liquida ad alta prestazione Fluorene metossilcloruro Rilevatore di fluorescenza 0.567-34
Cromatografia liquida ad alte prestazioni (HPLC-ELDS) / Rivelatore di dispersione della luce evaporativo 2.11-21.2
HPLC-DAD Fluorene metossicarbonile cloruro Rilevatore DAD 0.0163-0.3250
HPLC ad alte prestazioni con derivazione precolonna a fase inversa Fluorene metossicarbonile cloruro Rilevatore di fluorescenza  0.5-60
Cromatografia liquida ad alte prestazioni in fase inversa  Metil 9-fluorenil cloroformiato Rivelatore di fluorescenza 3.6-36
Spettrometria di massa quadrupolare in tandem con cromatografia liquida ad alte prestazioni / Sorgente di ionizzazione chimica a pressione atmosferica 0.482-2.410
Gascromatografia su colonna capillare Acetilacetato Con rilevatore di ioni di fiamma 0.01-10
Cromatografia liquida ad alte prestazioni di derivatizzazione precolonna 6-aminochinolina-N-idrossisuccinico carbammato Rilevatore di fluorescenza 0.5-25
Cromatografia liquida prederivata ad alte prestazioni in fase inversa 9-fluorene metil cloroformiato Rivelatore UV 2.0-60
Determinazione spettrofotometrica Soluzione per il test di ioduro di potassio e iodio Spettrofotometro UV-vis  0.25-4
HPLC-MS/MS / Spettrometro di massa 0.1-10
Cromatografia liquida ad alta prestazione / Rifrattometro differenziale 5.0-400.0
Colorimetria del sale di sequoia / Spettrofotometro ultravioletto 0.4-40.4

I vantaggi di DNJ

Abbassare la glicemia

Il DNJ ha una struttura simile all'α-1, 4-glucosio e può inibire in modo competitivo la produzione di zucchero nel metabolismo del corpo, quindi ha un effetto ipoglicemizzante e può essere usato per trattare il diabete e le sue complicanze, l'obesità e le relative disfunzioni.

L'effetto ipoglicemico di DNJ è stato studiato in topi diabetici indotti da alloxan e la reazione dei topi è stata osservata mediante integrazione orale di DNJ e polisaccaridi. È stato riscontrato che i livelli di glucosio nel sangue, emoglobina glicata, trigliceridi, aspartato aminotransferasi e alanina aminotransferasi sono diminuiti significativamente, il peso corporeo, il livello di insulina plasmatica e la lipoproteina ad alta densità sono aumentati in modo significativo nei topi diabetici alimentati con DNJ e miscela di polisaccaridi. La reazione a catena della polimerasi della trascrizione inversa ha mostrato che l'espressione del tipo GCK, PEPCK e G-6-Pase nel fegato e pdX-1, insulina-1 e insulina-2 nel pancreas erano regolate positivamente e negativamente dall'alimentazione mista di DNJ e polisaccaridi la zona. Regolazione e metabolismo del glicogeno epatico e gluconeogenesi. Poiché il DNJ non ha l'azione dei radicali liberi idrossilici e dei radicali liberi superossido, non può riparare le cellule β delle isole danneggiate, quindi può solo ridurre la glicemia a un certo livello ma non può tornare allo stato originale con l'aiuto dei polisaccaridi.

Inibizione del tumore

DNJ potrebbe inibire significativamente l'invasione, la metastasi e l'adesione cellulare delle cellule B16F10, con tassi di inibizione rispettivamente del 50%, 35% e 60%. L'attività di inibizione di MMP-2 e MMP-9 è stata significativamente inibita a 50 μg/mL e ha raggiunto il 20% a 50 μg/mL. Il tasso di inibizione dell'espressione dell'mRNA di MMP-2 e MMP-9 era rispettivamente del 60% e del 28%. Non vi è stato alcun effetto significativo sull'espressione dell'mRNA di TIMP1, ma l'espressione dell'mRNA di TIMP2 è stata aumentata del 31%. Inoltre, il DNJ ha aumentato i livelli di α-mannosio sulla superficie cellulare del 49%, ha ridotto i livelli di oligosaccaridi del 21% e i livelli di metilato del 30%. Questi risultati suggeriscono che il DNJ può essere utilizzato come agente adiuvante per inibire la metastasi delle cellule tumorali.

Virus inibente

Papandreou ha scoperto che basse concentrazioni di DNJ potrebbero inibire la regolazione del capside dell'HIV della fusione della membrana glicoproteica di CXCR4 e quindi inibire il danno dell'HIV al corpo. Inoltre, l'inibizione di DNJ contro il virus della leucemia murina Molony (MoLV) ha mostrato che DNJ aveva una significativa attività antiretrovirus con IC50 di 1.2-2.5 μg/ml e l'inibizione aumentava con l'aumento della dose di DNJ. Steinmann E et al. hanno scoperto che l'HCV è stato rapidamente ucciso dopo l'aggiunta di DNJ a catena alchilica lunga nel mezzo di coltura delle cellule infettate da HCV, indicando che il DNJ è un potenziale farmaco per il trattamento dell'epatite virale C.

Un gran numero di studi ha dimostrato che il DNJ ha una varietà di funzioni attive, tra cui l'abbassamento della glicemia, l'inibizione delle metastasi tumorali e l'attività antivirale, rendendolo un punto caldo della ricerca attuale. Il gelso è una delle specie con un contenuto relativamente alto di 1-DNJ, ma è limitato dal suo processo di produzione di estrazione e purificazione. La scoperta di geni che regolano la sintesi di DNJ nel ceppo Bacillus 3K85 fornisce anche una base per la sintesi su larga scala di DNJ da parte di microrganismi. Al momento, la polvere naturale 1-DNJ è diventata un punto caldo della ricerca.