La equinácea es una hierba perenne de la familia de las equináceas compuestas, que está incluida en la “Farmacopea de los Estados Unidos” como una de las fuentes de base medicinal de la equinácea. Se distribuye naturalmente en el centro-este de los Estados Unidos y el sur de Canadá, e históricamente es una medicina tradicional de los indios norteamericanos. Los estudios farmacológicos han demostrado que la equinácea tiene efectos inmunoestimulantes, antiinflamatorios y antivirales. Se ha convertido en una de las hierbas para mejorar el sistema inmunológico más utilizadas en el mundo y se utiliza como suplemento dietético. Los principales componentes efectivos de la equinácea, incluidos los derivados del ácido cafeico, la amida de alquilo, el polisacárido y el aceite volátil, etc., incluido el equinosido, un tipo de derivado del ácido cafeico, fueron material representativo de la hierba Echinacea, puede inhibir las células tumorales, antienvejecimiento, diabetes y otros beneficios, pero debido a que su contenido es bajo y difícil de separar, requisitos más altos para el instrumento, la medición es relativamente difícil. En la actualidad, la separación y el análisis se llevan a cabo principalmente mediante cromatografía líquida de alta resolución inversa (HPLC) gradiente de elución.

  1. Materiales de prueba

Las plantas de equinácea utilizadas en este experimento se cosecharon en agosto de 2020 en el período de máxima floración de la equinácea y se almacenaron en cuatro partes: tallo, hoja, raíz y cabeza, después de secarse a la sombra a -20 ℃. El equipo es el cromatógrafo de fase líquida de alto efecto Agilent1100, el detector externo púrpura AgilENT-G-1315B-DAD, la máquina desgasificadora en línea Agilent322A true space, el espectrómetro de color HPChem-Station, la trituradora universal oscilante de alta velocidad DFY-400, el análisis de electrones T2000Y, Instrumento de limpieza por ondas ultrasónicas SK82001HC, máquina centrífuga TG-16W.

Los reactivos incluyen acetonitrilo, metanol, ácido fosfórico, ácido acético glacial, etanol y otros reactivos cromatográficos puros, el agua es agua pura; Polvo de equinósido(De Rainbow Biotechnology Co., LTD., contenido ≥ 98% por HPLC).

2. Método de prueba

Preparación de la fase móvil

Colocación de solución de ácido fosfórico al 0.1 %: retire con precisión 1.00 ml de solución de ácido fosfórico en un matraz aforado y utilice agua pura para mantener el volumen en 1000 ml. Agítelo bien y ultrasónico durante 5 minutos para que la solución se mezcle por completo. Luego fíltrelo con un dispositivo de filtro de vacío y luego ultrasónico para eliminar las burbujas. La configuración de la solución de ácido acético glacial al 0.1%: retire con precisión 1.00 ml de solución de ácido acético glacial en una botella volumétrica, use agua pura para mantener el volumen constante a 1000 ml, agite bien, ultrasónico durante 5 minutos para que la solución se mezcle completamente, luego filtre con un dispositivo de filtro de vacío y ultrasónico para eliminar burbujas.

Elaboración de normas

Se pesó con precisión 0.01 g de equinacósido estándar, se disolvió en alcohol etílico al 70% y luego en un volumen constante de una botella de 10 mL, se preparó en licor madre de 1 mg·mL-1 de la sustancia de referencia. Absorba con precisión 1 ml de la solución madre de la sustancia de referencia de equinosido, colóquelo en un frasco etiquetado de 10 ml de volumen, dilúyalo con alcohol etílico al 70 % hasta el grado de precisión, agite bien, prepare una solución de almacenamiento de 0.1 mg·mL-1 de sustancia de referencia, deje reposar , luego filtrar con membrana microporosa (0.45 μm), el filtrado es la solución estándar de Equinoside.

Preparación de la solución

Los diferentes materiales de equinácea se secaron y pulverizaron por separado y se tamizaron a través de malla 100. Pese una cierta cantidad de cada muestra de polvo medicinal, péselo con precisión, agregue alcohol etílico al 70%, volumen constante a 10 ml, etiquete, agite bien, ultrasónico (40 kHz) durante 20 min y remoje en frío en un refrigerador a 4 ℃ durante 24 h. La extracción fue seguida por ultrasonidos (40kHz) por 20 min y centrado (3500r·min-1) por 10min. Absorber el sobrenadante y agregar etanol al 70% a 25 mL, agitar bien y colocar, filtrar con membrana microporosa (0.45μm), el filtrado es el líquido de prueba de cada muestra.

El análisis de datos

Se utilizó el software SPSS17.0 para el análisis de significación. P≤ 5% indicó diferencia significativa. Software Excel2007 para la elaboración de curvas estándar y el cálculo de la desviación estándar relativa (RSD); Para cada grupo de datos, se realizaron tres grupos de pruebas paralelas para obtener el valor promedio.

3. Resultados y análisis

Optimización de columna cromatográfica

La fase móvil fue acetonitrilo-ácido fosfórico al 0.1% (21∶79, v/v). La longitud de onda de detección fue de 330 nm, la temperatura de la columna fue de 30 ℃, el volumen de inyección fue de 10 μL y el caudal fue de 1.0 mL·min-1. En comparación con Agilent (tc-c185 μm 4.6 mm × 250 mm) y Diamonsil (5 μm C18, 4.6 mm × 250 mm), la separación de la solución estándar de ecolina fue mejor mediante el análisis de la solución estándar. Los resultados mostraron que Agilent (TC-c185 μ m4.6 mm×250 mm) tuvo un mejor efecto de separación sobre el pineósido.

Optimización de la fase móvil y el modo de elución

Se seleccionó Agilent (TC-C185 μm 4.6 × 250 mm), la longitud de onda de detección fue de 330 nm, la temperatura de la columna fue de 30 ℃, el volumen de inyección fue de 10 μL y la velocidad de flujo fue de 1.0 mL·min-1. La separación de la solución estándar de equinacósido con la fase móvil de metanol-agua (65∶35, V/V), acetonitrilo-0.1% ácido fosfórico (21∶79, V/V) y acetonitrilo-0.1% ácido acético glacial ( 21∶79, V/V) fue investigada. Los resultados mostraron que la velocidad de separación del equinacósido fue mejor cuando se usó metanol-agua (65∶35, V/V) como fase móvil (FIG. 1).

Se comparó la separación de pinhiósido por lavado de isogrado de alcohol metílico-agua de fase móvil (65∶35, V/V) y lavado de gradiente. Los resultados mostraron que la solución estándar de equinacósido se separó bien con elución en gradiente, y el procedimiento de elución específico fue el siguiente: El gradiente de elución de la fase móvil agua (A) y metanol (B) fue 58% B (0 ~ 1 min, v/V), 58 % ~ 62 % B (1 ~ 2 min, V/V), 62 % ~ 65 % B (2 ~ 4 min, V/v), 65 % ~ 58 % B (4 ~ 8 min, V/ V). El grado de separación del pineósido fue el mejor (FIG. 2).

Optimización de la longitud de onda de detección

Se comparó la absorbancia del equinacósido a 254, 327, 330 y 360 nm. Finalmente, la absorbancia del equinacósido fue mayor cuando la longitud de onda fue de 330 nm.

Optimización de la temperatura de la columna: Se comparó el efecto de separación del equinacósido a una temperatura de columna de 20, 25, 30, 35 ℃. Los resultados mostraron que el efecto de separación del pico cromatográfico del equinacósido fue bueno cuando la temperatura de la columna fue de 30 ℃.

Las condiciones cromatográficas

Las condiciones cromatográficas optimizadas fueron las siguientes: columna cromatográfica AGI-lent (TC-c185 μ m4.6 mm×250 mm), fase móvil metanol-agua, caudal 1.0 mL·min-1, longitud de onda de detección 330 nm, temperatura de la columna 30 ℃, volumen de inyección 10 μL, elución en gradiente.

Prueba de precisión

La solución estándar de equinacósido se inyectó 9 veces consecutivas para calcular la RSD del área del pico. Los resultados mostraron que la RSD del área del pico del echinacósido fue del 0.81 %, lo que indica que la precisión del instrumento era buena.

Examen de estabilidad

Prepare 0.1 g del mismo polvo de muestra de equinácea y la solución de muestra e inyecte 10 μL a las 0, 2, 4, 6, 8, 10, 12 y 24 h, respectivamente. Analice la muestra 8 veces consecutivas de acuerdo con las condiciones cromatográficas mencionadas anteriormente y calcule el valor RSD del área del pico. La RSD de pinocisido fue del 0.50 % y la desviación estándar relativa estuvo dentro del 5 %. Los resultados mostraron que la solución probada era estable dentro de las 24 horas.

Prueba de repetibilidad

Preparar 6 muestras del mismo polvo de muestra de equinácea, 0.1 g para cada muestra y la solución de la muestra para inyección de muestra y análisis en las condiciones cromatográficas mencionadas anteriormente. La RSD del área del pico de equinacósido fue del 2.23 %. Los resultados mostraron que el método tenía buena repetibilidad.

Prueba de recuperación

Los últimos 6 polvos de equinacósido con concentraciones conocidas se pesaron con precisión y se dividieron en concentraciones altas y bajas. Los datos relevantes mostraron que al medir la tasa de recuperación, la fase de dosificación adecuada debe ser de 0.5 a 2.5 veces el contenido del grupo de prueba. Añadiendo 10μg·mL-1 de pinósido, el contenido de la muestra fue 2 veces el contenido de la muestra. De acuerdo con la solución diseñada y las condiciones cromatográficas del método estándar externo para calcular la concentración, calcule la recuperación de cada compuesto y la recuperación del valor RSD.

Tasa de recuperación marcada (%) = (valor medido de la muestra de prueba marcada – el valor medido de la muestra)/escalar ×100.

La tasa de recuperación de equinacósido se calculó mediante la fórmula anterior. Al medir la tasa de recuperación, el límite permisible de tasa de recuperación es 80% ~ 120%, y la desviación estándar relativa está dentro del 5% cuando el contenido del componente probado es menor o igual a 1mg·L-1. Los resultados se muestran en la Tabla 3, que mostró que la recuperación de equinacósido osciló entre el 88.03 % y el 97.88 %, y la recuperación media fue superior al 93 %. La RSD fue de 2.17 % a baja concentración, 0.38 % a alta concentración y 1.28 % a nivel normal, lo que cumplió con los requisitos de la presentación en papel. Mostró que la tasa de recuperación era buena y que el método era factible.

Determinación del contenido de la muestra

La raíz, el tallo, la hoja, la inflorescencia y las cáscaras de la inflorescencia de la equinácea se midieron con precisión con 0.1 g de polvo, y la solución de prueba se preparó de acuerdo con el método descrito anteriormente y las muestras se analizaron en las condiciones cromatográficas especificadas, y el contenido de equinacósido en cada parte fue calculada por el método estándar externo. Cada muestra se midió tres veces en paralelo. La equinácea mostró diferentes contenidos de equinacósido en diferentes partes. El contenido de equinacósido en hojas fue el más alto (0.221%), el contenido de equinácea en cabeza fue 0.219%, que no fue significativo pero sí significativamente mayor que el de las raíces (0.132%), y el contenido de equinacósido en tallos fue el más alto. más bajo (0.075%).

La separación y el análisis del equinacósido son difíciles y no existe un método unificado. Pruebe comparando las diferentes columnas cromatográficas, la temperatura de la columna, la longitud de onda de detección, la fase móvil y la forma del análisis cuantitativo de los glucósidos de elución de la equinácea, la influencia del método de análisis cuantitativo optimizado de la equinácea, el método de análisis de separación optimizado para mejorar la forma del pico cromatográfico, después de la investigación de la metodología mostrar que el método de análisis cuantitativo es estable, preciso y reproducible, el método es simple y factible. La HPLC optimizada se realizó en una columna Agilent (tc-c185 μ m4.6 mm×250 mm) con una longitud de onda de detección de 330 nm, temperatura de columna de 30 ℃, un volumen de muestra de 10 μL, la fase móvil fue metanol-agua, caudal de 1.0 mL·min-1, gradiente de elución.

Los resultados mostraron que el contenido de echinacósido en la familia de la equinácea es variado y Echinacea angustifolia y Echinacea pallida tienen un contenido más alto que el de Echinacea purpurea, y el contenido de equinacósido en la parte aérea fue mayor que el de la parte subterránea. BINNS informó que las raíces de equinácea producidas en Canadá variaron entre 0 % y 0.054 %, y las raíces de equinácea contenían un alto contenido de equinacósido, hasta aproximadamente 0.6 %. Los resultados mostraron que el contenido de equinacósido en las raíces de Echinacea blanca de tres años fue de 0.596%. Según esta investigación, el contenido de equinacósido de echinacea purpurea varió mucho en diferentes partes, desde 0.075 % hasta 0.221 %, las hojas y las cabezas fueron más altas que las raíces y los tallos basales fueron los más bajos. Los fabricantes de extractos de equinácea en China e India actualmente tienen concentraciones de equinósidos que van del 0.01 % al 0.23 %, según el origen.